北京农业科学
BEIJING AGRICULTURAL SCIENEES
1999年 第17卷 第2期 Vol.17 No.2 1999



授粉后DNA直接导入技术在我国农业
分子育种中的应用进展
李远新　张淑玲　王关林　葛晓光
　　早在六七十年代，育种界掀起了远缘杂交育种的热潮。人们将远缘物种之间相互杂交，发现在光学显微镜下杂交后代染色体数目、形状、大小基本同母本类型，但其株型、穗部及其它经济性状方面，却发现有远缘父本的某些特征。Harlen和Dewet报道[1]玉米与摩擦禾的杂交后代的染色体完全恢复为玉米的(2n＝20)，但性状上有摩擦禾影响的明显变异。这些用经典遗传育种理论难以解释。70年代初，我国李贞生培育了玉米稻，其表现比母本穗大、粒大、抗寒、抗旱和高产，但其染色体数目与母本(水稻)相同。有人认为这可能是来源于玉米花粉物质的刺激作用，也有人认为这属自发变异或母本不纯而产生分离或者是品种间杂交的结果。周光宇认为：从近代分子生物学水平看，虽然就整体分子而言，亲缘关系愈远的生物间的染色体和DNA的结构愈不易亲和，很容易互相排斥，但从局部的DNA片段来看，两种植物的部分基因间的结构却可能保持一定的亲和性。因而当远缘DNA片段在母本DNA复制过程中有可能被重组而使子代出现变异。这种参与杂交的DNA片段可能带有可亲和远缘物种的结构基因、调控基因，甚至是断裂的毫无意义的DNA片段。整合到母本基因组中的这三种DNA片段都能影响母本基因表达而变异。这样，周光宇等提出常规远缘杂交中存在着DNA片段杂交的假设，并用试验验证了这一理论。在此理论基础上建立起授粉后外源DNA直接导入技术，并将这一技术广泛应用于我国农业分子育种实践中，取得了令人瞩目的成就。
1　在棉花上的应用进展
　　江苏农科院等单位经过多年上百种不同供受体的组合试验；包括自身DNA种内、种间、属间和科间等外源DNA导入，多数组合均能产生变异子代。从这些子代中选育了一批具有经济价值的后代，并证明3～4代即成为稳定遗传的品系。如把从海岛棉“416”种胚中提取的DNA微量注射到扣线自交后的陆地棉幼龄中，引起后代变异，得到稳定遗传后，从中选育出了比双亲在诸方面均表现出优势的99-4和102-4[2]。海岛棉7124DNA导入陆地棉9101的后代3118是高抗枯萎、耐黄萎病的棉花品系，产量比受体高出22.8%，比供体高100%。其绒长2.8cm，绒的强度达4g以上。抗枯萎病棉52-128DNA导入江苏棉1号和3号，获3072和3049两个高抗品系，保持了江苏棉的优良品质。在接有致病菌的土壤中，比江苏棉1号和3号分别增产30%和70%左右，抗性达到供体水平。有人用苘麻DNA导入海岛棉416筛选的一个品系比受体株高、龄大，产量提高，并保持了绒长的受体特性[3]。此外，尚有应用野生棉DNA或海岛棉DNA导入不同栽培棉中，获得不同程度的高产、优质、无酚或抗枯黄萎病的品系。谢道昕等(1991)[4]从Bt aizawai7-29和Bt kurstakikD-1中分离了两个杀虫基因，分别构建在植物表达载体PBI21.2和CA643上，通过花粉管途径，将这两种杀虫基因导入我国棉花品种中，获得转基因植株。分子杂交的结果证明杀虫基因已经整合到棉花基因组中。倪万潮等[5]也用该途径将合成的Bt杀虫蛋白基因导入棉花优良品种泗棉3号和中棉12号，获得了转基因植株。组织化学分析表明，GUS标记基因已在D1代植株中得到表达。现已形成抗虫棉群体。
2　在高粱、小麦上的应用进展
　　张孔恬等将高粱恢复系基因匀浆涂柱头，立即授以保持系新鲜花粉，达到了恢复系雄性可育基因外源导入的结果。这在育种方法上，为某些特异有益基因的转移开辟了一条新途径。王黎明等[6]采用同样方法将热带高粱总DNA导入寒带高粱品系中，后代在单穗粒重、茎粗、株高、穗形、壳色等均发生变异，D2代单株过氧化物酶和酯酶谱带均有变异。他们还以同样的方法获得了小麦恢复可育基因的转移。阎新甫等[7](1994)将抗白粉病大麦DNA通过花粉管途径直接导入感病的小麦品种“花76”中。他们不仅获得了符合遗传规律的稳定抗病后代，而且还确定了抗白粉病是由一对显性基因控制。曾君祉等[8]将含GUS标记基因的质粒PBI121的DNA用花粉管途径转化普通小麦品种“小山3号”的小花，从结实的106粒种子中，经点杂交初步筛选，再经Southern分子杂交鉴定，选出5株转基因小麦，转化率为4.7%。同时用荧光法和X-Gluc染色法测试，检测到这些植株中有GUS基因的表达产物β-葡糖甘酸酶存在。证明GUS基因已整合到小麦植株中，并得到了表达。
3　在水稻上的应用进展
　　在水稻方面，段晓岚等[9]用DNA注射法把大米草DNA注射到水稻“早丰”中，出现了株高只有35cm左右，根系发达的后代。在变异子代中有16种氨基酸含量明显提高。早熟紫玉米DNA导入水稻京3147的后代829042，第二代即已稳定。其植株形态仍如受体表型，但熟期显著提早，表现出早熟、耐旱、抗病、株型好、不易倒伏的特点。他们还把紫稻DNA直接滴于受体水稻自花授粉2～3小时后切去花柱的切口上，获得受体所没有的紫色性状。肖君泽等[10]用浸注法将玉米DNA直接注入水稻种胚内，再用此注射液进行浸泡，子代发生明显变异，表现在生育期短、植株矮化、结实率增加、米质变优等优点。Luo等[11]用含p35S-NPT-Ⅱ-Hist3的质粒DNA作供体对藤坂五号水稻品种的259朵小花进行了转化处理，收获了54粒种子。这些种子发芽后，对发生6天的根尖和生长8周的叶片进行了分子杂交检测(用p35S-NPT-Ⅱ作探针)，发现有10粒能发育成具NPT-Ⅱ酶活性的植株，证实了外源DNA已整合到了水稻基因组中。谢道昕等[12]以水稻品种“中花11号”为材料，采用花粉管通道法，成功地获得了转Bt杀虫基因的水稻植株。分子杂交实验证明杀虫基因已整合到水稻基因组中，与杀虫基因融合的报告基因GUS在转基因植株中得到了表达。
4　在大豆上的应用进展
　　雷勃钧等[13]在大豆自花授粉后，将野生大豆DNA导入栽培大豆引起了后代性状的广泛变异。刘广阳等[14]将半野生大豆DNA导入栽培大豆，培育成D89-9822新品系，该品系比受体增产44.9%，蛋白质含量比受体增长2个百分点。有人将pCaMV-neo质粒用同样的方法导入大豆，收获的种子用卡那霉素筛选，对14株有抗性的植株进行点杂交，其中13株有阳性反应。李希臣等[15]利用RAPD技术直接从DNA分子水平上证明了外源总DNA片段可以通过花粉管通道导入受体，并与基因组DNA整合。谢伟斌等[16]也用同样的技术将外源高蛋白野生大豆总DNA导入栽培大豆，后代有明显变异类型，表现在结荚数明显增多，且种子蛋白含量比受体提高12.5%。RAPD分析，从150个引物中找到24个引物检测出DNA的多态性，证明变异源于大片段外源DNA重组。
5　在玉米上的应用进展
　　王桂林等[17]以液滴法和喷雾法进行了谷子DNA向玉米自交系齐302和478导入试验。两种方法在D1代均产生变异，变异率为18%。齐302变异后代中有一雌穗顶端生长单枝雄穗且具分蘖、多穗的罕见变异。丁群星等[18]报道了用子房注射法将Bt毒蛋白基因导入玉米自交系，获得一株转基因玉米(T0)。通过自交得到了71株T1代的植株。转基因玉米(T0)经点杂交、Southern分子杂交以及PCR扩增均获得阳性结果：T1代中，有7株的PCR扩增呈阳性结果，对其中4株进行抗玉米螟测试，呈现一定的抗虫效果。他们在海南岛重复该试验，再次获得成功，说明这种方法是可重复的。
6　在蔬菜上的应用进展
　　DNA直接导入技术一经建立，蔬菜育种工作者便开始对多种蔬菜作物从事分子育种研究工作，并取得了显著的效果。1985年钟文田[19]以紫菜苔为供体，以旱皇白白菜自交系为受体，通过子房注射法将供体总DNA注入受体开花后不同时期的白菜角果，大白菜的后代获得在叶面、叶背或叶脉上程度不同的具有茸毛及叶片表现紫色羽状全裂、绿色羽状全裂等变异类型。许勇等[20]在中国长茄人工授粉24小时后，给其子房注射粘毛茄的总DNA，其后代变异的D1代株系中有23.48%的植株叶面着生硬刺，倾向于供体。多花序频率由5%提高到16.42%，有4.67%的植株的果形由细长形变为长圆型。D2代变异性状有分离。郭亚华等[21]以“苦瓜”及“津研四号”黄瓜为供体，授粉后以子房注射法将其总DNA导入“长春密刺”中，D1代在结果习性上出现了全雌性株，全雄性株，多雌少雄，多雄少雌变异性型。同时后代的植株长势、叶片大小、叶色、果形、抗病性等发生了明显的变化。董伟等[22]报道以“长春密刺”为供体，以“大白黄瓜”为受体，进行授粉后DNA子房注射。结果表明，受体皮色性状在后代发生变异，出现了绿皮黄纹、黄绿、灰绿等皮色的果实，且这些变异可遗传给后代。最近，哈尔滨师范大学生物系研究人员将鱼类特有的抗寒基因分离提纯后，通过花粉管途径导入番茄中，在后代中获得了明显的耐低温且高产材料[23]。廖芳心等[24]以花粉管导入法将抗黑腐病甘蓝PI281552总DNA导入主栽品种初秋中，D1代237株中有56株呈抗病反应。RAPD分析证明外源DNA进入受体。
　　尽管授粉后外源DNA直接导入技术在农业分子育种中取得了显著成果，但国内外许多学者仍对这一技术持有异议，有人指出：许多种植物的花粉管腔被胼胝质所阻塞，DNA分子难以顺着花粉管进入胚囊；花粉管内含有核酸酶，能把外源DNA分子分解掉。因此，外源DNA分子如何通过花粉管途径进入胚囊仍是人们争议的焦点。可见，外源DNA如何进入胚囊内的卵细胞，如何整合到基因组中的机理尚有待于进一步的探讨，许多作物的外源DNA转化技术还有待于进一步完善。但是大量的分子育种实践已充分表明，以DNA分子片段杂交假设为依据的授粉后DNA直接导入技术是农业分子育种的切实可行的手段，并已在作物品种改良中做出了重要贡献。这项技术易于掌握，将其与常规育种结合必将在农业分子育种
