环境科学学报
ACTA SCIENTIAE CIRCUMSTANTIAE
1999年 第19卷 第5期 Vol.19 No.5 1999



氯苯降解性质粒pL1限制性酶消化和物理图谱*
罗如新　张素琴　李顺鹏
摘要　大量提取L1菌质粒并用低熔点琼脂糖回收.用5种限制性核酸内切酶消化，所得片段数分别是：HindⅢ 4，BanHⅠ 16,XbaⅠ 4,PstⅠ 15,SmaⅠ 12.从各片段的累加测出该质粒的平均大小约为92.5kb,分子量为60.09×106dalton.在单酶消化的基础上，用HindⅢ/XbaⅠ、HindⅢ/BamHⅠ、XBaⅠ/BamHⅠ双酶消化，以及BamHⅠ部分消化，由此组建了HindⅢ/XbaⅠ/BamHⅠ3个酶的物理图谱.
关键词　质粒；限制性内切酶；物理图谱.
Restriction endonuclease digestion and physical map of chlorobenzene degradation plasmid pL1
LUO Ruxin (Dept.of Environmental Science and Engineering,Fudan University,Shanghai 200433)
ZHANG Suqin (Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071)
LI Shunpeng (Department of Microbiology, Nanjing Agricultural University Nanjing 210095)
Abstract　Plasmid from strain L1 was prepared on a large and reclaimed by agarose, low melting point. When pL1 DNA was digested by 5 restriction endonucleases, 4 fragments were obtained by Hind Ⅲ, 4 fragments by XbaⅠ, 16 fragments by BamHⅠ,15 fragments by Pst Ⅰ,13 fragments by Sma I.The genome average size was estimated to be 92.5 kb and molecular weight was 60.09×106 Dalton. On the basis of single digestion, pL1 DNA was digested with Hind Ⅲ/XbaⅠ,Hind Ⅲ/BamH Ⅰ and XbaⅠ/BamH I,and partially digested with BamH I. The physical map for pL1 was constructed from these data.
Keywords　Restriction endonucleases, physical map, degradation plasmid.
　　氯代苯类是一类重要的有机化工原料，广泛用于农药、医药和材料合成等行业，具有高的持久性和强的毒性，进入环境造成危害也特别严重.这类化合物的微生物氧化已有很多报道，对于微生物氧化的遗传基础也有很多研究.大多数卤代烃类的生物降解是由质粒控制的.pL1质粒是作者分离鉴定的氯苯降解性质粒［1］，为能进一步作基因定位和构建该质粒的基因图谱，本文应用部分消化法和双酶消化法，并结合“三三规则”［2］，组建了pL1质粒的物理图谱.
1　材料与方法
1.1　材料和试剂
　　细菌和质粒：L1菌为氯苯降解菌；pL1是存在于L1菌株的氯苯降解性质粒.试剂：Solution Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,STE buffer,TE buffer均参照文献［3］配制.培养基：高浓度肉汤培养基参照文献［3］配制.
1.2　方法
　　L1菌质粒的大量提取，参照文献［3］进行.低溶点琼脂糖(LMP)回收质粒DNA，参照文献［4］进行.双酶消化(1)两个酶对反应温度有不同要求时，则必须分别进行消化，要求低温的酶作第一个酶.(2)如果两个酶对缓冲液有同样的要求，可以同时进行混合酶切.如果对缓冲液的要求不一样，那么要求低盐缓冲液的酶作第一个酶，在消化之后，补加1mol/L NaCl 1.5μL调节盐浓度，然后加入要求高盐缓冲液的第二个酶，继续消化.部分消化同上设置反应体系，37℃反应10min,65℃灭活10min.电泳用0.7%和1%琼脂糖凝胶水平电泳，3V/cm,EB染色，紫外灯下观察并拍照.
2　结果
2.1　pL1质粒的单酶消化和双酶消化
　　pL1质粒经Hind Ⅲ、Xba Ⅰ、BamH Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ等酶消化后，所得片段数见表1.其中用Hind Ⅲ、Xba Ⅰ消化后从电泳图谱上可见浓浓的一条带(见图1)，根据亮度和分子量大小判断应是四条重叠带.根据Hind Ⅲ消化λDNA所作工作曲线，查出各片段大小(见表1).从表1可以看出Hind Ⅲ,Xba Ⅰ的4个片段的总和为92kb，BamH Ⅰ的16个片段的总和为94.14kb，Pst Ⅰ的15个片段的总和为94.25kb，Sma Ⅰ的12个片段的总和为91.8kb.由此，求出pL1质粒的平均大小为92.5kb,分子量为60.09×106dalton.
表1　单酶和双酶消化质粒片段及其分子量大小
Table 1 Fragments and teir size of plasmid DNA digested by single and double endonucleases 单位：kb
片段HindⅢHindⅢ/Xba ⅠXbaⅠBamHⅠ HindⅢ/BamHⅠXbaⅠ/BamHⅠPstⅠSmaⅠBamHⅠ部分消化
A23.016.623.019.910.4716.8720.6019.5122.31
B23.016.623.013.189.5512.2816.0012.6018.30
C23.016.623.09.508.719.5613.0011.0317.18
D23.016.623.08.717.707.249.509.1112.59
E　6.4　7.247.246.528.707.649.12
F6.45.015.885.017.606.788.53
G6.44.685.324.684.306.015.40
H6.44.475.014.503.715.504.51
I　3.984.683.982.344.803.89
J3.634.213.632.103.803.63
K3.393.983.241.802.803.39
L3.243.633.151.302.4　
M2.403.502.901.2　
N2.143.392.401.10
O1.413.242.141.00
P1.262.401.41　
Q　2.141.3
R1.411.26
S1.26　
T1.0
总计92929294.1494.7292.0693.0591.98
　　根据组建物理图谱的原理［2,3］,双酶消化环状DNA的片段长是：E1N+E2N，即双酶消化的片段数应是两个酶单独消化所得片段数之和.所以Hind Ⅲ/Xba Ⅰ消化得8个片段，Hind Ⅲ/BamH Ⅰ、XBa Ⅰ/BamH Ⅰ消化产生20个片段.双酶消化可能保留单酶消化的某些片段，另一些片段可能消失而出现新的片段，说明一个酶的切点可能正好在消失的片段之间，那么新出现的2个或3个片段的分子量之和必然等于那个消失的片段，根据片段的大小可找出消失片段与新生片段的关系，通过它们的交错重叠现象，可确定各片段的相邻位置.
2.2　pL1质粒的物理图谱
　　根据单酶切和双酶切分析，BamH Ⅰ切割所得的片段(D，F，I)、(E，L，P)、(G，J，M，N)之间的相互排列关系仍未能确定，故进一步做BamH Ⅰ部分消化来确定它们之间的邻近关系，结果见表1.通过分析计算定出BamH Ⅰ完全消化的16个片段的顺序的A—D—C—F—O—I—B—L—P—E—K—H—G—J—N—M.


图1　pL1单酶消化
a:λDNA Hind Ⅲ分子量标记　b.Hind Ⅲ单消化　c:Xba Ⅰ单消化　d:Pst Ⅰ单消化　e:BamH Ⅰ单消化
Fig.1 Electrophoresis pattern of pL1 DNA for single digestion


图2　质粒pL1的限制酶切图谱
Fig.2 Physical map of pL1 for the restriction endonuclease Hind Ⅲ/Xba Ⅰ/BamH Ⅰ
　　5种限制性内切酶对pL1质粒进行单酶切、双酶切以及部分酶切的结果汇总于表1，并绘出Hind Ⅲ/Xba Ⅰ/BamH Ⅰ三种酶的限制图谱(见图2).
3　讨论
　　用5种限制性内切酶消化，根据各酶消化片段累计而得的质粒大小为92.5?kb，分子量大小为60.09×106dalton.组建如此大小质粒的物理图谱，存在一定的困难，误差也在所难免.然而，物理图谱的组建都不是非常严密和精确的，正如Maniatis等［3］指出，即使方法先进，条件严格，也会有100bp左右的误差.为了不遗漏琼脂糖凝胶上的小片段(1kb以下的片段在0.7%的琼脂糖上难以观察)，最好能同时用聚丙烯酰胺进行电泳，即使如此，精确度也总是有限的.特别是对于降解质粒一般都是低拷贝的，需要大量制备质粒DNA，再回收利用，工作量也很大的.
* 国家自然科学基金(39370145)资助项目
作者单位:罗如新:复旦大学环境科学与工程系，上海　200433　张素琴:中科院武汉病毒研究所，武汉　430071
李顺鹏:南京农业大学微生物系，南京　210095)
参考文献
1　罗如新等.一氯化苯的微生物厌气降解及其降解性质粒的研究.南京农业大学学报，1997，20(2)：63—66
2　齐义鹏，黄永秀，梁明山编著.基因工程原理和方法.重庆：四川大学出版社，1988
3　Sambrook J et al. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual. 2nd ed. New York: CSH Lab Press,1989
4 侯云德编著.病毒基因工程的原理与方法.北京：人民卫生出版社，1985
1998-03-02收到原稿
1998-09-28收到修改稿
