环境科学学报
ACTA SCIENTIAE CIRCUMSTANTIAE
1998年 第18卷 第3期科技期刊
2，4-二硝基甲苯在鲤鱼体内的代谢研究*
王　宁　丁蕴铮　李金昶　郎佩珍
(东北师范大学环境科学系，长春　130024)
　　摘要 应用水生生物体内实验方法，研究了2,4-二硝基甲苯在鲤鱼肝肠提取物中的生物浓缩及代谢转化过程.半静态条件下，采用3种不同的暴露浓度，测定肝、肠组织的生物浓缩曲线，并同步对肝提取物进行HPLC检测.首次得到2，4-二硝基甲苯还原代谢的两种产物：4-氨基—2-硝基甲苯和2，4-二氨基甲苯，保留值分别为23.053min及8.789min.以实验证明了峰形生物浓缩曲线是发生代谢转化的结论，且对鱼类的毒性预测研究也予以证实.
　　关键词 2，4-二硝基甲苯；鲤鱼；肝提取物；代谢产物；鉴定.
　　硝基芳烃化合物2，4-二硝基甲苯(2，4-DNT)不仅是生产军需品和化工用品的重要原料，而且是美国EPA和我国早已确定的环境优先污染物.对于它的“三致”效应早有报道，且松花江水体和鱼体中已多次检出此类污染物，因此，研究2，4-DNT在鱼体内的富集、消除、转化和归趋，尤其是探讨其生物转化的过程和产物，是评价该化学品对水生态环境影响与危害的一个重要指标，在毒理学研究中有重要的理论和实际意义.
　　近年来哺乳动物(鼠、兔)体外实验证明，2，4-DNT在生物体内代谢转化为氧化或还原过程［1，2］.文献中尚未见有关2，4-DNT在水生生物体内转化的研究.鱼类毒性预测的QSAR研究［3，4］指出，LC50与最低空轨道能相关.朗佩珍等［5，6］的工作表明，鱼类对2，4-DNT的富集过程为峰形生物浓缩曲线，并预示发生了生物转化，作者在全鱼和肝提取物样品中，也曾得到未知物峰，但未鉴定出产物.
　　在上述工作基础上，本文参照2,4-DNT在哺乳动物体外代谢研究的成果，应用水生生物体内实验方法，在鲤鱼对2，4-DNT富集后，取肝、肠作前处理，GC测定其动力学曲线并经HPLC鉴定代谢产物，以研究鲤鱼对2，4-DNT的代谢作用.
1 实验部分
1.1 材料与试剂
　　2，4-DNT，　纯度＞98%，上海化学试剂采购供应站提供，经重蒸馏精制；4-氨基—2-硝基甲苯(4A2NT)，按文献［7］制备，经元素分析、红外光谱、质谱测定，组成与结构证明无误；2，4-二氨基甲苯(2，4-DAT)，纯度＞98%，美国Sigma公司购入；甲醇为北京化工二厂出品(优级纯)；其它化学试剂均为分析纯.
　　实验用1龄鲤鱼，长春市净月潭养鱼场提供，平均体重17g±9g.肝、肠重100mg—400mg，驯养两周以上，实验前一天停止喂食，实验时随机取样未辩别雌雄.以除氯自来水为实验用水，水质各项指标符合国家渔业水质标准(GB11607—89)，实验期间水温为15℃±1℃，排除挥发、光解等干扰.
1.2 实验方法
　　同时设计富集与代谢两组实验.80L玻璃制水族箱，投入健康鲤鱼58尾，参照预实验结果，2，4-DNT配制浓度为1ppm进行生物浓缩实验.3只40L水箱，各投20尾鲤鱼，根据多次预实验结果，2，4-DNT配制0.1ppm、1ppm和4ppm?!3种浓度梯度进行体内代谢实验.
　　实验均为半静态条件，每天换水50%［8］，富集实验在0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3，5，6，8，11，15，19，23，27，31，33，35，38，40d各取鱼两尾(平行)，用肝、肠作前处理，GC测定2，4-DNT在鱼体中的生物浓缩动力学曲线；代谢实验在0，2，5，8，11，15，19d各浓度组取鱼两尾(平行)，肝作前处理，以HPLC检测鱼体内2，4-DNT的代谢转化及代谢产物.
1.3 肝、肠前处理方法
　　解剖取鱼肝、肠，用滤纸轻吸水分，称重；入组织匀浆器，加入少量丙酮∶石油醚(59∶41，V/V)提取液匀浆，匀至组织细碎为止；用肝肠体积20倍的提取液多次清洗匀浆器，转至试管中；萃取5min，以900r/min离心机离心5min，去除不溶物质；定容至10mL，以备GC测定；离心后的肝提取液用无水硫酸钠及中性氧化铝干燥、净化；在65℃条件下加Sngder柱流水蒸干或用N2吹至干，去除有机溶剂，用甲醇定容到0.5mL，以备HPLC检测代谢产物.
1.4 分析测试条件
1.4.1 GC-ECD分析条件　色谱仪：日本岛津GC-7AG型气相色谱(配岛津CR-3A型数据处理机)；检测器：63Ni放射源电子捕获检测器；色谱柱：玻璃填充柱3m×2mm(内径)固定相为3%SP-2250，涂渍于80/100目的Suplcoport(美国)；载气：氮气(99.999%)，流速：50mL/min；温度控制：汽化室250℃，检测器250℃，柱温200℃；进样量：1μL.
1.4.2 HPLC分析条件　色谱仪：日本岛津产LC-6A型高效液相色谱仪；色谱柱：ZOrBax ODS C18柱(4.6mm(内径)×250mm(长)，填充物粒径5μm)；流动相：甲醇为0.005mol/L,Na2HPO4溶液(pH=7.0),梯度程序：甲醇浓度由20%—100%；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；检测波长：254nm.
2 结果与讨论
2.1 结果
　　经2，4-DNT在鱼肝、肠富集动力学实验，得到两条生物浓缩曲线及数据，如图1.

图1 鱼体肝、肠中2，4-DNT浓度随时间变化曲线
Fig.1 Variation in concentration of 2,4-DNT in fish liver and intestine
　　从图1可见，鲤鱼肝、肠对2，4-DNT的生物浓缩曲线呈现如下特点：曲线有明显峰形，8天前波动较大，出现两次上升下降的过程，为双峰形特征，且呈肝肠同步的趋势.此峰形曲线与2，4-DNT在鲤鱼全鱼体内富集的曲线相比，具基本相同的峰形和趋势.
　　首次从鱼肝浓缩样品中分离和鉴定出2，4-DNT的还原代谢产物.代谢实验的2种不同暴露浓度共15个样品中，经与标准物保留值(图2)核对，1ppm浓度组富集第2d与第15d肝浓缩样品中检测出较高浓度的还原代谢产物峰，即4-氨基—2-硝基甲苯(4A2NT)及2，4-二氨基甲苯(2，4-DAT)，(见图3—图5).

图2 2，4-DNT及其代谢产物标样HPLC保留值(a.2,4-DAT　b.4A2NT c.2,4-DNT)
Fig.2 HPLC retention values of 2,4-DNT and standards of metabolins (a.2,4-DAT；b.4A2NT,c.2,4-DNT)

图3 鱼肝空白样品HPLC保留值
Fig.3 HPLC retention values of control fish liver

图4 富集2d鱼肝样品HPLC保留值(a.2,4-DAT b.4A2NT c.2,4-DNT)
Fig.4 HPLC retention values of fish liver after 2d uptake (a. 2,4-DAT, b.4A2NT, c.2,4-DNT)

图5 富集15d鱼肝样品HPLC保留值(a.2,4-DAT b.4A2NT c.2,4-DNT)
Fig.5 HPLC retention values of fish liver after 15d uptake (a.2,4-DAT,b. 4A2NT, c.2,4-DNT)
2.2 讨论
2.2.1 对峰形浓缩曲线意义的认识及鱼类毒性预测的证明　将鲤鱼肝肠组织对2，4-DNT富集动力学实验得到的生物浓缩曲线与检测出的代谢产物进行对比，发现，伴随生物浓缩曲线的下降阶段(如图1的第2d和第15d)，均可检测出代谢产物.证明了峰形生物浓缩曲线是生物对某种化学品富集与转化的宏观表征.曲线的上升阶段，可预示生物对化学品的富集，而其下降阶段是由生物浓缩过程中发生代谢转化所致.这一观点首次被实验所证明.
　　郎佩珍等［3］通过研究硝基芳烃化合物对黑呆头鱼的毒性定量构效关系表明，系列化合物的生物毒性与分子最低空轨道能(ELUMO)具有较好的相关性，推测其毒性与其在鱼体内转化为活性代谢物的反应有关.代谢反应主要发生在硝基处的亲核取代与还原等.尤其是二硝基甲苯等，在生物体内易发生还原反应或亲核取代反应与大分子键合.本文进行的鲤鱼对2，4-DNT的富集、代谢实验结果证实了这一推测.
2.2.2 关于鱼肝提取液中2，4-DNT代谢机制和途径的探讨　化学品进入生物体内，经血液输送到肝脏，在肝细胞滑面内质网膜中存在的酶催化下发生一系列代谢转化.肝微粒体酶系统，可催化氧化或还原性代谢反应.从本文实验工作推测，硝基芳烃化合物发生酶促转化的主要酶系是鱼肝微粒体中的硝基还原酶、芳烃羟化酶［9］及肠道微生物酶系［2］作用，这方面研究有待进一步工作证实.
　　根据2，4-DNT的转化机制可知，它在鲤鱼体内的代谢转化为还原代谢过程，代谢途径遵循哺乳动物(鼠、免)体外代谢研究［1］中的结论.2，4-DNT经酶作用，首先代谢为亚硝基甲苯，然后代谢为氨基硝基甲苯，经过亚硝基羟基化合物的中间代谢过程，最后还原为2，4-二氨基甲苯.虽然我们未检测到亚硝基氨基和亚硝基羟基氨基化合物等中间产物，但从化学品的还原过程和鱼的表观现象推测，2，4-DNT的代谢途径为逐步还原代谢过程.
2.2.3 关于代谢产物出现不规律特点的探讨　代谢实验5d 3种不同暴露浓度共15个肝提取液样品中，仅富集第2d和第15d 1种暴露浓度样品中检测出较高浓度的代谢产物，其他时间有时未检出，有时峰值很小，且无规律.我们认为：影响化学品在生物体内代谢转化的因素有两方面.
　　第一方面是生物个体的因素.生物体本身的因素是影响生物转化的一个主要条件.个体差异即健康状况和生物的性别因素尤为重要.健康状况可引起生物体内代谢水平和酶活性的变化，改变生物转化的速度；另外，生物的性别差异对化学品的代谢转化可明显不同，对哺乳动物的研究实验证明，常规雌性鼠较雄性鼠代谢2，4-DNT的能力快，且易进入正常循环随尿排出，而雄性鼠中的2，4-DNT易经肠作用后回到肝与大分子键合，因此在雌性鼠中检测的2，4-DNT代谢产物往往多于雄性［1］.
　　第二方面因素是底物浓度的影响.从3种暴露浓度分析，仅1ppm水中测出较明显的代谢产物，证明底物浓度是制约生物体内2，4-DNT代谢转化的关键因素之一.底物浓度过高，可能产生中毒现象，抑制鱼体内的酶促反应发生；底物浓度过低，则不能激发酶的活性，达不到适当的酶促反应速度(据米氏方程).所以，底物浓度的因素不可忽视.
3 结论
　　(1)首次应用HPLC标准物保留值核对法在鱼体内鉴定出2，4-DNT在生物富集过程中发生转化的两种代谢产物，即4-氨基—2-硝基甲苯(4A2NT)和2，4-二氨基甲苯(2，4-DAT)；证明2，4-DNT在鲤鱼体内代谢转化的途径为还原代谢过程.
　　(2)鲤鱼肝、肠组织生物浓缩曲线出现峰形，其下降阶段是由于生物浓缩过程中发生代谢转化所致.
　　(3)从实验方面验证了鱼类急性毒性QSAR研究所预测的LC50与硝基芳烃化合物在鱼体内代谢转化过程相关的结论.
　* 国家自然科学基金重大项目(99290600)资助课题
参考文献
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　6 赵晓明，郎佩珍，张笑天等.鲤鱼对三种硝基芳族化合物的摄取、释放和生物富集.环境化学，1994，13(5)：433—438
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　9 朱蓓蕾.动物毒理学.上海：上海科技出版社，1989
METABOLISM OF 2，4-DINTROTOLUENE IN CARPS (CYPRINUS CARPIO L)
Wang Ning, Ding Yunzheng, Li Jinchang, Lang Peizhen
(Department of Environmental Science, Northeast Normal University, Changchun 130024)

ABSTRACT In vivo metabolism and bioconcentration of 2,4-dinitrotoluene(2,4-DNT) in liver and intestine of carps (Cyprinus Carpio L.) were investigated using semistatic system. Two metabolites of 2,4-DNT were separated from liver and identified as 4-amino—2-nitrotoluene(4A2NT) and 2,4-diamino toluene (2,4-DAT) on HPLC. Their retention times were 23.503 and 8.789 min, respectively. Such results demonstrated our inference that metabolism caused the declines in bioconcentration curves, and provided new experimental supports for research on toxicity of chemicals to fished.
Keywords 2,4-dinitrotoluene, carps, liver extract, metabolites, identification.
1996-08-12收到原稿
1996-12-30收到修改稿
