湖北农业科学
HUBEI AGRICULTURAL SCIENCES
1998年第6期　总第339期科技期刊
植物病毒保藏和检测的简易方法
张　忠　周履谦　李天宪　熊克娟
(中国科学院武汉病毒研究所　武汉　430071)

　　摘要　为适应基层科研单位需要，介绍用氯化钙干燥法保藏植物病毒，用血清学方法(免疫双扩散技术和对流免疫电泳技术)检测植物病毒的具体方法。
　　关键词　植物病毒　保藏　检测

　　植物病毒病是当前国内外较为严重的病害。在农作物、果树、花卉、蔬菜和林木上均有发生，给国民经济造成巨大损失。植物病毒的保藏和检测与病原调查、病害检疫及植病防治有很大关系。植物病毒的保藏方法很多。有条件的单位通常用液氮和冷冻干燥

收稿日期：1998-04-02
张忠：男，40岁，实验师
法。但因使用冻干机和经常灌液氮，不仅麻烦，而且成本较高，很多单位无法办到。保藏前后的检测方法最好是电镜检测，但一般单位不具备这样的条件。这里介绍植物病毒保藏和检测的简易方法，不需什么昂贵的设备，保藏病毒只需一台普通冰箱，而在进行病毒检测时用的是血清学方法。该简易方法保藏的植物病毒与用冻干和液氮方法保藏



1　氯化钙干燥法保藏植物病毒
1.1　材料
　　铝针盒、剪刀、纱布、胶布、氯化钙(CaCl2)、标签。
1.2　方法
　　1)感病的嫩叶组织用血清学方法进行检测(方法下述)，如呈阳性结果，则可进行保藏。
　　2)取半面铝针盒，内放适量氯化钙，上铺2层纱布。
　　3)将感病的嫩叶组织，去主脉，剪成碎片，放在纱布上面。病叶与氯化钙的重量比为1∶5左右。氯化钙越多，效果越好。
　　4)盖上铝盒。中间接缝处用胶布贴紧。贴上标签。贮于4℃冰箱，备用。
　　5)因氯化钙极易吸潮，故动作要迅速、敏捷。
　　6)几个病毒同时作保藏时，工作人员作完1种病毒后，应洗手，所用器械用酒精灯消毒或更换，以防交叉感染。

2　血清学方法检测植物病毒
2.1　免疫双扩散技术
2.1.2　材料
　　玻璃平板或直径6cm培养皿、pH8.6巴比妥缓冲液(或硼酸缓冲液)、琼脂糖、三角瓶、10ml吸管、保湿的大培养皿、样品孔排列图样及打孔器。
2.1.2　方法　
　　1)配制pH8.6巴比妥缓冲液：称巴比妥钠10.3g，巴比妥1.84g，双蒸水加至1000ml。
　　2)配制1%琼脂糖凝胶：称取琼脂糖1g，加到100ml上述巴比妥缓冲液中。灭菌30min。
　　3)用吸管吸取适量琼脂糖凝胶，均匀铺在玻璃平皿上，使凝胶层厚度为2mm。待凝固后，放在样品孔的排列图样上，用打孔器打孔，并取出孔内凝胶。然后用滤纸吸干孔内水分，用溶化凝胶封孔底(如琼脂糖凝胶凝固，可将装琼脂糖凝胶的三角瓶放入沸水中加温，使之溶化)。
　　4)在凝胶梅花型的孔穴中，中央孔加入已知的植物病毒抗血清，周围孔加入待测病叶提取汁液。
　　5)将加入样品的凝胶板，放在大培养皿中保湿。37℃反应2～6h或室温过夜。
　　6)根据沉淀线出现情况，判断反应有无和强弱。
2.2　对流免疫电泳技术
2.2.1　材料
　　电泳仪、电泳槽、巴比妥缓冲液、琼脂糖、玻璃平板、滤纸和已知抗血清。
2.2.2　方法
　　1)用研钵磨碎植物叶片，若汁液较少，可加少许磷酸盐缓冲液。
　　2)用上述缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。
　　3)用吸管吸取5ml凝胶，均匀铺在玻璃平板上(3.0cm×7.5cm)，待冷却后，用打孔器打出对距为3～4mm、间距为3mm左右的2排孔穴。方法同琼脂双扩散。
　　4)一排孔加入抗血清，另一排孔分别加入健康叶片汁液、待测病叶的汁液和已知抗原。
　　5)电泳槽中倒入1000mlpH8.6的巴比妥缓冲液，将加入样品的凝胶板悬架在电泳槽中间，两边用滤纸搭桥。
　　6)抗体端接正极，抗原端接负极，通电45min左右，电压150V。
　　7)当抗体和抗原之间出现沉淀线时，判为阳性；反之为阴性。
